Определение коньюгатов желчных кислот

ПРОГРАММА ИССЛЕДОВАНИЯ

Провести определение содержания конъюгатов желчных кислот в предоставленных образцах после предварительной дериватизации методом газовой хроматографии.

ХОД АНАЛИЗА

Приготовление градуировочных растворов

Навески стандартных образцов желчных кислот (около 1 мг) были растворены в 1 мл метанола. В 3 ампулы было внесено 0,1, 0,2 и 0,3 мл полученного раствора и объем доведен до 1 мл. К полученным растворам было прибавлено по 0,1 мл раствора диазометана в диэтиловом эфире до образования стойкого желтого окрашивания не исчезающего в течение 2 мин. После 5 мин выдержки растворы были упарены на водяной бане досуха в токе азота. К сухому остатку было прибавлено 1 мл силилирующей смеси (ацетонитрил/гексаметилдисилазан/триметилхлорсилан 9/3/1) и 1 капля пиридина. Амулы были запаяны и выдержаны на кипящей водяной бане 30 мин, после чего были охлаждены до комнатной температуры и подвергнуты дальнейшим исследованиям.

Подготовка образцов

В ампулы было помещено 100 мкл вытяжек из желчи и упарено на водяной бане в токе азота. Дальнейшая пробоподготовка аналогична приготовлению градуировочных растворов (конечная аликвота 1 мл).

Хроматографическое определение

Анализ проводился на газовом хроматографе Neochrom, оснащенным ПИД детектором и колонкой DB-5 (length – 30m, i.d. – 0,25mm, film – 0,25µm), детектор - 320ºС, испаритель - 320ºС, газ-носитель – водород, деление потока 1 к 20, ввод пробы – ручной, 1. Программа: 100ºС изотерма 3 минуты – подъем температуры со скоростью 15ºС в минуту до 350 ºС – термостатирование 10 минут. Значимые фрагменты хроматограмм раствора образца и одного из градуировочных растворов представлены на рисунках 1, 2 и 3.

Расчет содержания желчных кислот проводился методом внешнего стандарта (расчет по градуировке). Градуировочные графики представлены на рисунках 4 и 5. Идентификация компонентов проводилась путем сопоставления времен выхода идентифицируемых веществ с временем выхода стандартных образцов.

Результаты и обсуждения

Представленный метод подходит для определения содержания конъюгатов холевой и дезоксихолевой кислоты с глицином с пределом чувствительности менее 1 ррм в пробе. Таурохолевая и тауродезоксихолевая кислоты, при данной пробоподготовке, не образуют дериватов пригодных для их количественного определения – требуется пересмотреть пробоподготовку, и подобрать условия для количественного перевода таурохолатов и тауродезоксихолатов в соединения пригодные для ГХ анализа.

По количественному определению, линейности и пр.

Были получены градуировочные зависимости исследуемых компонентов и определен коэффициент корреляции по 3-м точкам. Заметим, этот показатель (по опыту нашей лаборатории). может быть улучшен до 0,99 и более при использовании внутреннего стандарта. Использованием внутреннего стандарта возможно после подбора условий дериватизации.

В образце «Желчь Б» гликохолевой и гликодезоксихолевой кислот не обнаружено, содержание гликохолевой и гликодезоксихолевой кислот в образце «Желчь С» составило 62,4 ppm и 35 ppm соответственно. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 Содержание желчных кислот в образцах

№ пп	Образец	Гликодезоксихолевая кислота	Гликохолевая кислота	Предел обнаружения
1	Желчь «Б»	Менее 1 ррм	Менее 1 ррм	1 ррм
2	Желчь «С»	35 ррм	62,4 ррм	1 ррм

Выводы

Апробирована методика определения содержания желчных кислот в желчи. Методика требует доработки, но уже на данном этапе получилось достичь запрошенной чувствительности (предел обнаружения 1 ррм) и простой пробоподготовки. Результаты показаны в разделе «результаты и обсуждения», а так же в таблице 1. Хроматограммы представлены на рис 1 – 5.

Получение воспроизводимой аналитической формы таурохолатов и тауродезоксихолатов избранным методом не удалось, однако, возможно в дальнейшем

Рисунок 1 Хроматограмма градуировочного раствора 3 (110 ppm ГДХ и 90 ppm ГХ)